Понятие о дифференциальной экспрессии генов. Дифференциальная экспрессия генов в процессе развития. Общее представление о росте и развитии

Краткое описание

Онтогенез – непрерывный процесс количественных и качественных изменений, происходящих в организме в течение всей жизни при постоянном взаимодействии генотипа и условий среды. Термины «онтогенез» и «филогенез» ввел в биологию зоолог Е.Геккель. Термин «онтогенез» означает процесс индивидуального развития особи, «филогенез» - история развития вида. Согласно биогенетическому закону индивидуальное развитие особи является как бы кратким повторением филогенеза.

Вступление
Что такое дифференцировка?
Цитогенетические основы дифференцировки в онтогенезе
Дифференцировка соматической клетки в онтогенезе
Дифференциальная экспрессия генов
Выводы
Список литературы

Вложенные файлы: 1 файл

Визуальное наблюдение в электронный микроскоп, как наиболее прямой подход к изучению уровня транскрипции, т.е. генной активности, проведено в отношении только отдельных генов - рибосомных, генов хромосом типа ламповых щеток и некоторых других. На элекгронограммах отчетливо видно, что одни гены транскрибируются активнее других. Хорошо различимы и неактивные гены.

Особое место занимает изучение политенных хромосом. Политенные хромосомы - это гигантские хромосомы, обнаруживаемые в интерфазных клетках некоторых тканей у мух и других двукрылых. Такие хромосомы есть у них в клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов и средней кишки. Они содержат сотни нитей ДНК, которые редуплицировались, но не подверглись расхождению. При окраске в них выявляются четко выраженные поперечные полосы или диски. Многие отдельные полосы соответствуют местоположению отдельных генов. Ограниченное число определенных полос в некоторых дифференцированных клетках образует вздутия, или пуфы, выступающие за пределы хромосомы. Эти вздутые участки находятся там, где гены наиболее активны в отношении транскрипции. Было показано, что клетки разного типа содержат разные пуфы. Изменения в клетках, происходящие в ходе развития, коррелируют с изменениями в характере пуфов и синтезом определенного белка. Других примеров визуального наблюдения генной активности пока нет.

Все остальные этапы экспрессии генов являются результатом сложных видоизменений продуктов первичной генной активности. Под сложными изменениями подразумевают посттранскрипционные преобразования РНК, трансляцию и посттрансляционные процессы.

Имеются данные по изучению количества и качества РНК в ядре и цитоплазме клеток организмов, находящихся на разных стадиях эмбрионального развития, а также в клетках различных типов у взрослых особей. Обнаружено, что сложность и число различных видов ядерной РНК в 5-10 раз выше, чем мРНК. Ядерные РНК, которые представляют собой первичные продукты транскрипции, всегда длиннее, чем мРНК. Кроме того, ядерная РНК, изученная на морском еже, по количеству и качественному разнообразию идентична на различных стадиях развития особи, а мРНК цитоплазмы отличается.в клетках разных тканей. Это наблюдение приводит к мысли о том, что посттранскрипционные механизмы влияют на дифференциальную экспрессию генов.

Примеры посттранскрипционной регуляции экспрессии генов на уровне процессинга известны. Мембранно-связанная форма иммуноглобулина IgM у мышей отличается от растворимой формы дополнительной аминокислотной последовательностью, позволяющей мембранно-связанной форме «заякориваться» в клеточной мембране. Оба белка кодируются одним локусом, но процессинг первичного транскрипта протекает по-разному. Пептидный гормон кальцитонин у крыс представлен двумя разными белками, детерминированными одним геном. У них одинаковые первые 78 аминокислот (при общей длине 128 аминокислот), а различия обусловлены процессингом, т.е. опять наблюдается дифференциальная экспрессия одного и того же гена в различных тканях. Есть и другие примеры. Вероятно, альтернативный процессинг первичных транскриптов играет очень важную роль в дифференцировке, однако остается неясным его механизм.

Большая часть мРНК цитоплазмы одинакова по качественному составу в клетках, относящихся к различным стадиям онтогенеза. мРНК необходимы для обеспечения жизнедеятельности клеток и детерминируются генами «домашнего хозяйства», представленными в геноме в виде нескольких нуклеотидных последовательностей со средней частотой повторяемости. Продуктами их активности являются белки, необходимые для сборки клеточных мембран, различных субклеточных структур и т.д. Количество этих мРНК составляет примерно 9/10 от всех мРНК цитоплазмы. Остальные мРНК являются необходимыми для определенных стадий развития, а также различных типов клеток.

При изучении разнообразия мРНК в почках, печени и головном мозге мышей, в яйцеводах и печени кур было обнаружено около 12000 различных мРНК. Лишь 10-15% были специфичны для какой-либо одной ткани. Они считываются с уникальных нуклеотидных последовательностей тех структурных генов, действие которых специфично в данном месте и в данный момент и которые называются генами «роскоши». Количество их соответствует примерно 1000-2000 генов, ответственных за дифференцировку клеток.

Не все гены, имеющиеся в клетке, вообще реализуются до этапа образования мРНК цитоплазмы, но и эти образовавшиеся мРНК не все и не во всяких условиях реализуются в полипептиды и тем более в сложные признаки. Известно, что некоторые мРНК блокируются на уровне трансляции, будучи в составе рибонуклеопротеиновых частиц - информосом, вследствие чего происходит задержка трансляции. Это имеет место в овогенезе, в клетках хрусталика глаза.

В ряде случаев окончательная дифференцировка связана с «достройкой» молекул ферментов или гормонов или четвертичной структуры белка. Это уже посттрансляционные события. Например, фермент тирозиназа появляется у зародышей амфибий еще в раннем эмбриогенезе, но переходит в активную форму лишь после их вылупления.

Другим примером является дифференцировка клеток, при которой они приобретают способность реагировать на определенные вещества не сразу после синтеза соответствующего рецептора, а только в определенный момент. Показано, что мышечные волокна в своей мембране имеют рецепторы к медиаторному веществу ацетилхолину. Интересно, однако, что эти холинорецепторы обнаруживали внутри цитоплазмы клеток-миобластов до образования ими мышечных волокон, а чувствительность к ацетилхолину возникала только с момента встраивания рецепторов в плазматическую мембрану во время образования мышечных трубочек и мышечных волокон. Этот пример показывает, что экспрессия генов и тканевая дифференцировка могут регулироваться после трансляции в процессе межклеточных взаимодействий.

Исследуя все выше сказанное мы можем сделать выводы: дифференцировка клеток не сводится только к синтезу специфических белков, поэтому применительно к многоклеточному организму эта проблема неотрывна от пространственно-временных аспектов и, следовательно, от еще более высоких уровней ее регуляции, нежели уровни регуляций биосинтеза белка на клеточном уровне. Дифференцировка всегда затрагивает группу клеток и соответствует задачам обеспечения целостности многоклеточного организма.

Список литературы

“Современная генетика” Айала Ф., Кайгер Дж., М. 1987г.
Корочкин Л.И. “Взаимодействие генов в развитии”, М. 1977 г.
«Генетика» Меркурьева Е.К. и др. М.1991г.
http://5fan.ru/wievjob.php?id= 6571
http://afonin-59-bio.narod.ru/ 2_heredity/2_heredity_self/hs_ 16_onto.htm

Наследственность осуществляется путем передачи ядерной преформации, которая в ходе развития находит свое выражение в процессе цитоплазматического эпигенеза.

Э. Б. ВИЛЬСОН (1925)"

Две клетки дифференцированы по-разному, если, обладая одинаковым геномом, они синтезируют разные белки.

Φ. ЖАКОБ и Ж. МОНО (1963)

Введение

Генетика развития изучает проблему реализации наследственных потенций оплодотворенного яйца в течение жизни организма. Когда мы наблюдаем развитие зародыша, становится очевидным, что в клетках разных типов экспрессируются разные гены. Гемоглобин, например, характерен для эритроцитов, тогда как кристаллин обнаруживается только в клетках хрусталика глаза. Клетки сетчатки способны передавать электрические импульсы на большие расстояния, а прилежащие к ним клетки пигментного эпителия черны от гранул меланина и лишены способности проводить электричество. А между тем клетки каждого из типов образуются в результате митотических делений одного и того же оплодотворенного яйца, и, следовательно, ядра клеток каждого типа должны содержать одинаковую информацию. Развитие, таким образом, осуществляется посредством избирательного включения специфических генов в соответствующем месте и в соответствующее время. Отсюда рождается и проблема, которой занимается генетика развития: какие именно механизмы обусловливают такое избирательное включение, в результате которого возникают различия между клетками?

Центральная гипотеза генетики развития заключается в том, что дифференцировка клеток происходит без генетических изменений. Другими словами, предполагается, что в любом организме все соматические клетки содержат одинаковый набор генов. Следовательно, разные типы дифференцированных клеток должны использовать разные гены из этого общего для всех клеток наследственного материала. Данные, положенные в основу гипотезы дифференциальной экспрессии генов, получены как в генетических, так и эмбриологических исследованиях. В этой главе мы обсудим работы, посвященные вопросу о том, происходят ли в процессе развития необратимые изменения генома.

Тождество геномов

Некоторые крупные неделящиеся клетки личинок двукрылых (таких, как Drosophila и Chironomus ) содержат политенные (многонитчатые) хромосомы. В этих хромосомах репликация ДНК происходит без последующего митоза, и поэтому они содержат 512, 1024 и даже больше двойных спиральных молекул ДНК вместо одной (рис. 9.1 и 9.2). Клетки с политенными хромосомами никогда не делятся. Эти хромосомы можно увидеть с помощью светового микроскопа и различить характерную для них исчерченность. У дрозофилы в гаплоидном наборе хромосом насчитывается примерно 5150 дисков. В некоторых тканях в политенных хромосомах видны широкие полосы, внутри которых после спе-

1 Цит. по кн.: Э. Вильсон. Клетка и ее роль в развитии и наследственности. т. 2. с. 974. Изд-во АН СССР. M.-Л., 1940. 1062 с. Перевод с англ. В. А. Дорфмана и М.С. Навашина.

Гилберт С.

66________________ ГЛАВА 9

циальной обработки можно обнаружить два или более тонких дисков. В ряде генетических работ (Judd, Young, 1973) высказывалось предположение о наличии корреляции между числом этих дисков или хромомер, и числом генов у мухи (Swanson et al., 1981). Число политенных хромосом и характер исчерченности на протяжении всего личиночного периода остаются неизменными (Beermann, 1952; рис. 9.3). При сравнении политенных хромосом в разных тканях личинки не было

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ________________ 67

выявлено утраты какого-либо из их участков. Когда появилась возможность изучать индивидуальные хромосомы позвоночных, удалось установить, что число хромосом в разных тканях взрослого организма постоянно (Tjio, Puck, 1958). Как мы узнаем позже, в разных исследованиях было показано, что состав и свойства ДНК, экстрагированных из разных соматических тканей, очень сходны.

Другие данные, свидетельствующие об эквивалентности генома, были получены в эмбриологических исследованиях. Дриш и Шпеман (гл. 8) четко показали, что ядра ранних бластомеров морских ежей и тритонов тотипотентны , т.е. способны обеспечить дифференцировку любых типов клеток. В их опытах бластомер. который в норме должен был бы дать начало лишь части зародыша, оказался способным дать в процессе развития целый организм. Следовательно, его ядро должно было содержать гены , необходимые для образования всех других типов клеток Кроме того, Шпеман обнаружил, что проспективное значение клеток, взятых у зародыша тритона на стадии ранней гаструлы, меняется после пересадки их в другую область зародыша. Можно ли экстраполировать результаты этих эмбриологических исследований на клетки, которые уже детерминированы к дифференцировке в определенном направлении? Сохраняют ли детерминированные или дифференцированные клетки другие потенции к развитию? Излагаемые ниже данные, полученные в двух направлениях исследований, приводят к положительному ответу на эти вопросы.

Трансдетерминация

Личинка дрозофилы после вылупления имеет две четко различающиеся популяции клеток. Ее ткани образованы примерно 10 000 клеток. У большей части клеток имеются политенные хромосомы; эти клетки интенсивно растут, увеличиваясь в объеме примерно в 150 раз. Помимо этого, еще около 1000 клеток с диплоидными (неполитенными) ядрами образуют скопления в различных областях личинки. Такие скопления недифференцированных клеток называются имагинальными дисками (от латинского слова «имаго», означающего «взрослый»). Эти клетки делятся в течение всего периода роста личинки. Во время метаморфоза гормон экдистерон вызывает огромные изменения во всем организме (гл. 19). Личиночные клетки дегенерируют, тогда как имагинальные диски получают сигналы к дифференцировке в органы взрослой мухи. На рис. 9.4 показано расположение имагинальных дисков и перечислены структуры, которые из них развиваются.

Клетки имагинальных дисков личинки детерминированы. Так, например, глазной диск можно удалить у одной личинки и имплантировать его в брюшко другой. После метаморфоза муха, развившаяся из этой второй личинки, будет иметь

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

68________________ ГЛАВА 9 ______________________________________________________________________________

лишний глаз на брюшке. Если трансплантировать часть имагинального диска, то разовьется только часть глаза. Таким образом, трансплантация диска или его фрагмента личинке – прекрасный метод для тестирования состояния их детерминации, т.е. того, какая структура или ее фрагмент возникнет из этого диска при метаморфозе. Однако, когда диски трансплантируют взрослым мухам, они не дифференцируются, а их клетки продолжают пролиферировать. Эти пролиферирующие клетки можно непрерывно культивировать, пересаживая их от одной взрослой мухи к другой. Вместе с тем можно вновь тестировать состояние детерминации клеток диска путем удаления у мухи фрагментов растущих дисков и помещения их в личинку, претерпевающую метаморфоз (рис. 9.5).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

___________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ______________ 69

Рис. 9.6. Трансдетерминация структур антенны в структуры ноги. А. Трансдетерминация антеннального диска, пересаженного по схеме, показанной на рис. 9.5. Помимо нормальных структур антенны (А III – третий антеннальный сегмент: Ар – аристы) развились структуры ноги, такие, как тарзальные щетинки(ТЩ ) и связанные с ними бракты (б). Б. Голова взрослой мухи, несущей мутацию Antennapedia . У этого мутанта антенны почти полностью превратились в нормальные ноги. Мутации, обусловливающие превращение одной структуры в другую, называются гомеозисными мутациями (гл. 18). Хотя механизм трансдетерминации дисков, вероятно, отличается от механизма гомеозисных мутаций, оба они демонстрируют изменения судьбы дисков. (А – из Gehring, 1969; с любезного разрешения W.T. Gehring; фотография на рис. 9.6. Б . любезно предоставлена J. Haynie.)

Эрнст Халорн с коллегами (Hadorn, 1968) использовали методику пересадки дисков, чтобы показать, что клетка может изменять свое коммитированное состояние. Обычно фрагменты диска, детерминированного к образованию антенн, продолжали образовывать антеннальные структуры каждый раз, когда их тестировали, даже после нескольких серийных трансплантаций таких фрагментов взрослым мухам. Однако результат одного опыта удивил исследователей: вместо монотонного образования антеннальных структур участки антеннального диска формировали части ног, ротового аппарата или крыла. Это явление названо трансдетерминацией. Вместо развития в «собственный» орган имагинальные клетки развивались в другую часть взрослой мухи. Например, из диска, в норме детерминированного к развитию антенны , могла возникнуть структура, свойственная ноге взрослой мухи (рис. 9.6). Кроме того, подобно исходному состоянию детерминации, трансдетерминированное состояние оказалось относительно стабильным и наследовалось клетками диска на протяжении многих поколений.

Трансдетерминация чаще наблюдается после нескольких пассажей через взрослых мух и происходит преимущественно в определенных направлениях (рис. 9.7). Из диска крыла, например, могут возникнуть структуры груди, но грудные диски никогда не дифференцируются в части крыла. Генитальные диски могут дать начало антеннам или ногам, но никогда не наблюдается образования генитальных структур из дисков других типов. Причина такой направленности остается неизвестной, однако ясно, что детерминированные клетки могут дать начало иным типам клеток, чем те, которые образуются из них в норме. Следовательно, в клетках имагиналь-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

70________________ ГЛАВА 9

ных дисков сохраняются гены для специфических продуктов, которые в норме синтезируются клетками других типов.

Метаплазия

Результаты экспериментов по регенерации глаз у тритонов показали, что даже дифференцированные клетки взрослого организма могут сохранять потенции к образованию клеток других типов. Удаление сетчатки у тритона стимулирует ее регенерацию из пигментного эпителия, а новый хрусталик может сформироваться из клеток дорсальной радужки. Этот последний тип регенерации (названный вольфовской регенерацией по имени ученого, первым обнаружившего это явление) интенсивно изучался Тунео Ямадой и его коллегами (Jamada, 1966; Dumont, Jamada, 1972). Они обнаружили, что после удаления хрусталика происходит ряд событий, в результате которых радужка образует новый хрусталик (рис. 9.8).

1. Меняется форма ядер клеток радужки.

2. В клетках дорсальной части радужки образуется огромное количество рибосом.

3. ДНК этих клеток реплицируется, и вскоре клетки начинают делиться.

4. Происходит дедифференцировка этих клеток. Они выбрасывают меланосомы (продукты дифференцировки. придающие глазу его характерный цвет), которые перевариваются макрофагами, проникающими в рану.

5. Клетки дорсальной части радужки продолжают делиться, формируя дедифференцированную ткань в области удаленного хрусталика.

6. В дедифференцированных клетках радужки начинается синтез специфических для клеток хрусталика продуктов белков кристаллинов.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ______________ 71

Эти белки синтезируются в такой же последовательности, как и при развитии нормального хрусталика.

7. Как только сформировался новый хрусталик, деления клеток дорсальной части радужки прекращаются.

Перечисленные события нельзя считать нормальным путем образования хрусталика. Вспомним, что в эмбриогенезе хрусталик образуется из слоя эпителиальных клеток, индуцированных клетками передней стенки глазного пузыря. Процесс формирования хрусталика из дифференцированных клеток радужки называется метаплазией; явление это состоит в превращении (трансформации) одного типа дифференцированных клеток в другой. Следовательно, данные, полученные генетиками и биологами развития, подтверждают гипотезу дифференциальной экспрессии генов в генетически идентичных ядрах.

Клонирование у амфибий: ограничение потенций клеток

Окончательно решить вопрос о том, является ли сужение функций ядра дифференцированной клетки необратимым, было бы можно, проверив способность этого ядра индуцировать образование дифференцированных клеток любого другого типа. В 1938 г. Ганс Шпеман предложил, по его словам, «фантастический» опыт, чтобы ответить на вопрос о том, действительно ли геномы в разных клетках идентичны. Для этого следует имплантировать ядро какой-либо дифференцированной клетки в яйцо, собственное ядро которого предварительно было удалено. Если любое пересаженное ядро идентично ядру зиготы, то оно должно обеспечить полное развитие организма. Однако для проведения такого опыта необходимо было прежде всего разработать три методики: I) методику энуклеации яиц-реципиентов без их разрушения. 2) методику изоляции неповрежденных ядер; 3) методику переноса таких ядер в яйцо без повреждения и ядра, и яйца.

Указанные методики были разработаны Робертом Бриггсом и Томасом Кингом. Эти исследователи комбинировали энуклеацию яйца с его партеногенетической активацией. Если яйцеклетку леопардовой лягушки (Rana pipiens ) уколоть стеклянной иглой, то в ней начнут происходить все цитологические и биохимические изменения, связанные с оплодотворением: разрушаются кортикальные гранулы , перемещается внутренняя цитоплазма, а вблизи анимального полюса завершается мейоз.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

72________________ ГЛАВА 9 _____________________________________

Положение мейотического веретена в яйце легко определить, поскольку на анимальном полюсе пигментные гранулы удаляются от него и прокол яйца в этом месте приводит к вытеканию мейотического веретена вместе с хромосомами наружу (рис. 9.9). Теперь яйцо является и активированным (так как процессы, необходимые для начала развития, свершены), и одновременно энуклеированным. В энуклеированные яйца переносят ядра из клеток-доноров. Для этого клетку разрывают, с помощью микропипетки захватывают ее ядро и вводят его в яйцо-реципиент. Вместе с ядром в яйцо попадает и некоторое количество окружающей его цитоплазмы клетки-донора, но соотношение цитоплазмы донора и реципиента столь ничтожно (1:10 5), что вряд ли она оказывает какое-либо влияние на исход опыта.

В 1952 г. Бриггс и Кинг (Briggs, King, I952) показали, что ядра, взятые у зародыша на стадии бластулы, будучи перенесенными в цитоплазму яйцеклетки, обеспечивают развитие полностью сформированного головастика. Еще раньше Шпеман продемонстрировал, что клетки бластулы не детерминированы и, следовательно, их ядра тотипотентны. Поэтому если система переноса ядер работает, то ядра бластулы должны быть способны обеспечить полное развитие. Именно это и наблюдается в опытах по пересадке ядер бластулы. Шестьдесят процентов всех имплантированных ядер оказались способными направлять развитие яиц до стадии свободно плавающего головастика; все эти головастики были диплоидными (результат, подтверждающий, что их ядра происходили из ядра клетки-донора). Следовательно, система переноса ядер работает и ее можно использовать для изучения потенций ядра (рис. 9.10).

Что произойдет, если в активированное энуклеированное яйцо пересадить ядро из клетки зародыша, находящегося на более продвинутой стадии развития? Результаты опытов Кинга и Бриггса (King, Briggs, 1956) суммированы на рис. 9.11. Из этого рисунка видно, что большинство ядер из клеток

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ___________________ 73

бластулы способны обеспечить развитие яиц-реципиентов до стадии нормальных свободно плавающих головастиков, однако в ядрах, взятых от доноров, находящихся на более поздних стадиях развития, эта способность резко ограничивается. Ни одно из ядер соматических клеток , взятых на стадии хвостовой почки, не могло дать информацию, необходимую для развития нормального зародыша. Однако, когда на той же стадии брали ядра половых клеток (в норме дающих после оплодотворения начало целому организму), в 40% случаев были получены бластулы, способные к дальнейшему развитию (Smith, 1956). Следовательно, соматические клетки, становясь детерминированными и дифференцированными, по-видимому, утрачивают способность обеспечивать полное развитие организма. Было показано, что ограничение потенций ядер по мере развития является стабильным и тканеспецифическим признаком. Данные в пользу этого получали в следующих опытах. Число энтодермальных ядер, взятых на стадии поздней гаструлы, увеличивали путем серийных пересадок. С этой целью одно ядро переносили в энуклеированное яйцо; развившийся в результате такой процедуры зародыш имел на стадии бластулы тысячи идентичных ядер. Ядра этой бластулы снова переносили в энуклеированные яйца и таким образом получали много копий первоначального ядра, что позволяло количественно оценить его потенции. Такая методика называется клонированием ядер (рис. 9.12). При трансплантации неклонированных ядер наблюдается большая изменчивость в способности ядер, полученных от разных доноров , обеспечивать развитие. Некоторые ядра обеспечивают весь путь развития до стадии свободно плавающего головастика, тогда как другие - только до стадии аномальной гаструлы. Кинг и Бриггс считали эту изменчивость в разных клонах нормальной. Однако они обнаружили, что в пределах одного клона все ядра обладают одинаковыми потенциями. Каждый клон имел «характерный» фенотип, и часто стадия, на которой останавливалось развитие особей, полученных в результате пересадки ядер потомков одного клонированного ядра энтодермальной клетки, была сходной. Это наблюдалось и при трансплантации ядер, клонированных в течение нескольких поколений. Кроме того, если личинки развивались с какими-либо дефектами, то эти дефекты у всех личинок были одинаковыми. Все личинки с клонированными ядрами имели энтодермальные структуры (а именно, кишку), но у них отсутствовали некоторые производные мезодермы или эктодермы. По-видимому, ядра из клеток энтодермы пригодны для формирования энтодермы, но их способность к формированию эктодермы или мезодермы ограничена. Сходная утрата потенций была обнаружена и в ядрах клеток эктодермы (DiBerardino, King, 1967). Аномальные головастики имели превосходно дифференцированные нейральные структуры, но у них отсутствовали энтодермальные производные. Таким образом, прогрессивное ограничение потенций ядер по мере развития является, по-видимому, общим правилом. Не исключено, что ядра разных дифференцированных клеток отличаются друг от друга.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

74________________ ГЛАВА 9 ______________________________________________________________________________

Клонирование у амфибий: исключения из ограничения потенций

Можно, однако, и по-иному объяснить ограничение потенций ядер в дифференцированных клетках. Перенося ядро дифференцированной клетки в цитоплазму зрелого яйца, мы тем самым заставляем его вернуться к теперь уже не свойственному ему физиологическому состоянию. У лягушек в период дробления ядра клеток делятся с очень высокой скоростью, тогда как в некоторых дифференцированных клетках они делятся редко или не делятся вообще. Неспособность к репликации ДНК быстро приводит к поломкам хромосом: такие хромосомные аномалии наблюдаются во многих клетках головастиков, развившихся из яиц, содержавших клонированные ядра. Джон Гёрдон и его коллеги, используя несколько измененную методику пересадки ядер, получили результаты, показывающие, что многие из ядер дифференцированных клеток остаются тотипотентными.

Главное различие между опытами Гёрдона и опытами Бриггса и Кинга заключалось в выборе объекта исследований. Гёрдон изолировал ядра из клеток Xenopus laevis , южноафриканской шпорцевой лягушки. Эта лягушка (рис. 9.13) гораздо более

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 75

Рис. 9.15. Процедура получения половозрелых особей шпорцевой лягушки посредством трансплантации ядер клеток кишечного эпителия головастика в энуклеированные яйца. Хромосомы в яйце шпорцевой лягушки дикого типа (с двумя ядрышками 2- nu ) разрушают УФ-облучением и вводят в него ядро клетки кишечного эпителия головастика шпорцевой лягушки из линии с одним ядрышком (1- nu ). В одних случаях яйцо не делится, в других развитие зародыша нарушается, но в ряде случаев развивается нормальная взрослая особь, клетки которой содержат одно ядрышко. (По Gurdon, 1968, 1977.)

примитивна, чем Rana pipiens; y нее отсутствуют веки, среднее ухо и даже язык, столь характерный для позднее эволюционировавших видов Rana. Шпорцевая лягушка отличается также и по биологии развития. В отличие от леопардовой лягушки взрослая особь Xenopus способна регенерировать утраченные конечности; раннее развитие у нее протекает в три раза быстрее, чем у леопардовой лягушки. В частности, для достижения стадии хвостовой почки зародышу Rana pipiens требуется 80 ч, тогда как Xenopus laevis достигает той же стадии развития всего за 26 ч. Следовательно, ядра энтодермальных клеток на стадии хвостовой почки у шпорцевой лягушки имеют такой же возраст, как ядра из клеток ранней гаструлы у Rana (McKinnell, 1978).

Гёрдон также обнаружил постепенную утрату потенций ядер по мере развития (рис. 9.14). Однако из этого правила выявились интересные исключения. Гёрдон переносил ядра из энтодермальных эпителиальных клеток кишечника, взятые у головастика Xenopus на стадии перехода к активному питанию, в активированные энуклеированные яйца.

Ядра клеток донора имели генетический маркер одно ядрышко на клетку (линия 1-nu ) вместо обычных двух (линия 2- nu ). Из 726 пересаженных ядер только 10 оказались способными обеспечить развитие зиготы до стадии донора. Число ядер, обеспечивающих развитие, удалось повысить до 7% (Gurdon. 1962) с помощью метода серийных пересадок (переноса ядра из клеток кишечника в яйцо и после достижения яйцом-реципиентом стадии бластулы, последующего переноса ядер клеток бластулы в большее число яиц). В некоторых случаях ядра были способны реализовать информацию, достаточную для достижения стадии головастика и образования клеток всех линий нейронов, клеток крови и др. Кроме того, семь головастиков (развившихся после пересадки в яйца ядер, полученных клонированием двух исходных ядер) метаморфизировали и превратились в половозрелых взрослых лягушек (Gurdon, Uehlinger. 1966). Эти ядра были тотипотентными (рис. 9.15).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

76________________ ГЛАВА 9 _______________________________________________________________________________

Однако Кинг и его коллеги с сомнением отнеслись к опытам Гёрдона, считая, во-первых, что исследователи не приняли достаточных мер предосторожности, исключающих возможность использования вместо ядер кишечника ядер первичных половых клеток, которые, мигрируя, часто задерживаются в кишке , и. во-вторых, что эпителиальные клетки кишечника таких ранних, перешедших на активное питание головастиков могут не обладать свойствами вполне дифференцированных клеток. У них эти клетки еще содержат желточные пластинки (DiBerardino, King, 1967; McKinnell, 1978; Briggs, 1979).

В ответ на эти критические замечания Гёрдон и его коллеги провели следующие опыты. Они культивировали эпителиальные клетки из кожных межпальцевых перепонок ноги взрослой особи Xe nopus. Эти клетки были, безусловно, дифференцированными, потому что каждая из них содержала кератин – белок, характерный для клеток кожи взрослых особей. Когда ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйца, ни одно из ядер не обеспечивало развития зародышей дальше нейрулы. Однако после клонирования ядер и их пересадки в энуклеированные яйца из таких яиц развивались многочисленные головастики: правда, все они погибали, не переходя на активное питание (Gurdon el al.. 1975). Сходную остановку развития наблюдали другие исследователи (Wabl et al., 1975), пытаясь получить взрослых лягушек при пересадке ядер лимфоцитов. Ди Берардино (DiBerardino, 1987) пришла к заключению, что «на сегодня еще не доказано, что ядра клеток хотя бы одного какого-либо специализированного типа или клеток взрослого организма являются тотипотентными».

Результаты опытов по клонированию ядер у амфибий позволяют сделать два вывода. Во-первых, в них можно увидеть общее правило ограничения потенций в процессе развития. Это ограничение генетически детерминировано и характерно для ядер определенного типа клеток-доноров. Во-вторых, можно легко убедиться в том, что геном дифференцированной клетки обладает изумительной способностью инициировать образование всех типов клеток головастика. Ядро эритроцита лягушки, в котором никогда не происходит репликации ДНК (и синтеза мРНК), может претерпеть при серийных пересадках в общей сложности свыше 100 делений и все же сохранить способность обеспечивать развитие энуклеированного и активированного яйца в свободно плавающего головастика (Orr et al., 1986). Другими словами, даже если еще и ведутся споры о тотипотентности таких ядер, то в том, что они в высокой степени полипотентны, сомневаться не приходится. Ясно одно многие неиспользованные гены клеток кожи или крови могут реактивироваться и обеспечить образование нервов, желудка и сердца свободно плавающего головастика.
Дополнительные сведения и гипотезы: Клонирование

Как мы уже убедились ранее, обсуждая работы Ру и Дриша, детали экспериментальной методики могут сильно повлиять на получаемые результаты. Незначительное изменение процедуры клонирования ядер леопардовой лягушки привело к тому, что ядра, взятые даже на поздней стадии развития, обеспечивали развитие нормальной личинки. Салли Хеннен (Hennen, 1970) показала, что эффективность действия ядер донора можно увеличить, обработав их перед трансплантацией спермином или охладив яйца после пересадки, чтобы дать ядру время для адаптации к цитоплазме яйца. Обрабатывая таким способом ядра энтодермальных клеток, взятых у зародыша леопардовой лягушки на стадии хвостовой почки, и пересаживая затем эти ядра в энуклеированные яйца, Хеннен в 60% случаев получала нормальных личинок (в контрольных опытах процент таких личинок был равен нулю). Однако обработка ядер, взятых из дифференцированных клеток кожи взрослых лягушек, спермином не приводила к развитию взрослых особей из энуклеированных яиц, в которые пересаживали эти ядра.

Клонирование человека из дифференцированных клеток, похоже, стало задачей некоторых журналистов и писателей (писатели задавались целью воспроизводить важных политических деятелей, таких, как Гитлер или Кеннеди, а журналисты возмечтали распространить эту методику на атлетов и кинозвезд). Из предыдущего обсуждения очевидно , что клонирование полностью развитого индивидуума из дифференцированных клеток невероятно трудное дело, да и результаты этих опытов не вполне убедительны. Даже у амфибий ядра дифференцированных клеток, взятые у взрослого животного, не способны после их пересадки в активированные и энуклеированные яйца обеспечить развитие из этих яиц взрослого животного.

Но даже если бы и удалось вырастить взрослых лягушек из яиц, в которые были пересажены ядра дифференцированных клеток, то этот результат

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ________________ 77

Рис. 9.16. Процедура переноса ядер в активированное энуклеированное яйцо млекопитающего. Одноклеточный зародыш, инкубируемый в среде с колцемидом и цитохалазином, удерживают на месте присасывающей пипеткой. Энуклеирующей пипеткой прокалывают прозрачную оболочку (zona pellucida) и втягивают в пипетку прилежащую к пронуклеусам клеточную (плазматическую) мембрану вместе с частью клетки, содержащей пронуклеусы. Затем энуклеирующую пипетку вытягивают из яйца {А) и тем самым удаляют из него содержащую пронуклеусы цитоплазму. Клеточная мембрана остается неразрушенной; стрелкой указана связь с плазматической мембраной яйца. Б. В пипетке клеточная мембрана образует пузырек с цитоплазмой и пронуклеусами внутри. В. Этот пузырек вместе с вирусом Сендай вводят в перивителлиновое пространство между прозрачной оболочкой и мембраной другой энуклеированной зиготы. Г . Вирус Сендай способствует слиянию энуклеированного яйца с окруженными мембраной пронуклеусами, что позволяет им попасть в клетку (стрелка). Полярное тельце, лежащее возле присасывающей пипетки, в реакцию слияния не вступает. (Из McGrath, Soller, 1983; с любезного разрешения авторов.)

нельзя экстраполировать на человека. Не говоря уже об этических проблемах, при работе с человеческим материалом исследователь сталкивается с многочисленными трудностями. Если у самки амфибий одновременно созревают сотни яиц, то у женщины ежемесячно образуется очень мало зрелых яиц. Кроме того, цитоплазма из яйцеклетки женщины может существенно отличаться от цитоплазмы яйцеклетки лягушки по своей способности воспринимать сигналы, исходящие из ядра клетки, которая находится на более продвинутой стадии развития.

Пересадки ядер были впервые осуществлены у мышей. С этой целью у одной зиготы удаляли оба пронуклеуса и замещали их пронуклеусами. взятыми из другой зиготы (McGrath, Solter, 1983). Процедура этого опыта показана на рис. 9.16. Сначала одноклеточных зародышей инкубируют в среде с цитохалазином и колхицином, чтобы ослабить микрофиламенты и микротрубочки цитоскелета. Затем зародыша удерживают на месте с помощью присасывающей пипетки, а пипеткой для энуклеации прокалывают прозрачную оболочку (zona pellucida) яйца. Цитоплазматическую мембрану клетки энуклеирующей пипеткой не прокалывают, а лишь нажимают ею на область, где находятся пронуклеусы, и втягивают внутрь пипетки этот участок мембраны вместе с прилежащей к нему цитоплазмой и пронуклеусами (А). Затем пипетку оттягивают и тем самым цитоплазму с пронуклеусами отделяют от яйца. Эта цитоплазма окружена плазматической мембраной (Б). Пипетку с пронуклеусами, окруженными мембраной, погружают в каплю, содержащую инактивированный вирус Сендай, который вызывает слияние мембран. После всасывания некоторого количества вируса пипетку приближают к другой зиготе, из которой таким же образом были удалены пронуклеусы. Прокалывают прозрачную оболочку и вводят пронуклеусы вместе с окружающей их мембраной в перивителлиновое пространство между оболочкой яйца и его плазматической мембраной (В). Затем зародыш инкубируют при температуре 37С до момента слияния мембраны яйца-хозяина и донора ядер (Г). Таким образом два пронуклеуса донора попадают в цитоплазму хозяина. Через пять дней культивирования зародыши достигают стадии бластоцисты, и их можно имплантировать в матку приемной псевдобеременной взрослой самки. Родившийся мышонок имеет фенотип мыши, служившей донором ядер.

Свыше 90% энуклеированных зигот мыши, получивших ядра из других зигот, успешно развивались до стадии бластоцисты. Когда же в энуклеированные зиготы пересаживали ядра 4-клеточных

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

78________________ ГЛАВА 9 ___________________________________________________________________________

зародышей, ни одна зигота (из 81) не достигала стадии бластоцисты. Точно так же ядра из клеток 8-клеточного зародыша и из клеток внутренней клеточной массы были не способны поддерживать развитие до предимплантационных стадий (McGrath. Solter. 1984). В отличие от морских ежей и амфибий у мышей ядра ранних бластомеров (которые, как известно, являются тотипотентными) не способны обеспечить полное развитие. Эти опыты не удаются, по-видимому, из-за того, что ядра бластомеров не могут правильно функционировать в цитоплазме зиготы. Таким образом, вряд ли стоит серьезно относиться к идее (высказанной в сентябре 1984 г. в журнале «National Examiner») о клонировании второго Элвиса Пресли из его дифференцированной клетки. Однако свойства ранних бластомеров не у всех млекопитающих одинаковы: разные виды сильно различаются по времени активации и имплантации зародышей в матку. Недавно появилось сообщение (Willadsen, 1986) о том, что, используя модифицированную методику трансплантации ядер , автор получил ягнят из зигот, в которые были пересажены ядра бластомеров 8-клеточного зародыша. У мыши ядра бластомеров не способны направлять развитие зиготы, а у овцы они, по-видимому, могут это делать. Если указанное сообщение подтвердится, его результаты будут иметь огромное значение для сельского хозяйства.

Случаинесомненной способности ядер клеток взрослого организма обеспечивать развитие другого взрослого организма обнаружены только у растений. Эта способность чрезвычайно четко продемонстрирована на клетках моркови и табака. В 1958 г. Стюард и его коллега разработали методику, позволившую получить из дифференцированной ткани корня моркови целое новое растение (рис. 9.17). Из корня моркови изолировали маленькие кусочки флоэмы и вращали в больших колбах, содержащих молоко кокосового ореха (которое на самом деле является его жидким эндоспермом). Оно содержит различные факторы и питательные вещества, необходимые для роста растений, а также гормоны, необходимые для их дифференцировки. В этих условиях клетки флоэмы делятся и формируют неорганизованную ткань, называемую каллусом. Непрерывное вращение вызывает выталкивание отдельных клеток из каллуса в суспензию. Из этих единичных суспендированных клеток образуются корнеподобные узелки, которые продолжают расти все время, пока остаются в суспензии. Если эти узелки перенести на среду, уплотненную агаром, то из них развиваются остальные части растения: в конце концов образуются целые растения моркови, способные к размножению (Steward et al., 1964; Steward, 1970).

Весь процесс развития от единичной клетки до цветущего растения в условиях вращающейся культуры наблюдать невозможно, однако Вазил и Хильдебрандт (Vasil, Hildebrandt, 1965) проследили эти события, изолировав единичные клетки табака и наблюдая за их развитием или непосредственно, или с помощью цейтраферной киносъемки. Как и из клеток моркови, из клеток табака образовывались растеньица, которые могли расти и давать семена.

Клетки табака дают нам еще один пример тотипотентности ядер. Все гены, необходимые для образования целого растения, имеются в ядре дифференцированной клетки. Однако растения и животные развиваются по-разному. Вегетативное размножение отводками (т.е. частями растения, которые. получая питательные вещества, регенерируют недостающие части) представляет собой обычный прием в практике сельского хозяйства. В отличие от животных (у которых половые клетки обособляются

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ___________________ 79
очень рано в развитии в виде отчетливой клеточной линии) у растений в норме гаметы образуются из соматических клеток. Поэтому нет ничего удивительною в том, что единичная клетка может давать начало другому типу клеток и сформировать генетически однородный клон (от греч. klon, что означает «ветвь»).

Итак, мы можем сделать вывод, что дифференциальная утрата генов не является причиной дифференцировки. Ядра дифференцированных клеток содержат большую часть, а возможно, и все гены зиготы: эти гены экспрессируются в соответствующих условиях. Следовательно, процесс дифференцировки включает в себя селективную экспрессию разных частей генома. Нам предстоит более глубокое исследование проблемы постоянства генома и дифференциальной экспрессии генов с привлечением методов молекулярной биологии и клонирования генов. В следующей главе обсуждение этой проблемы будет продолжено на уровне современной молекулярной биологии.

ЛИТЕРАТУРА

Процесс, в результате которого отдельные ткани в ходе дифференцировки приобретают характерный для них вид, называется гистогенезом. Дифференцировка клеток, гистогенез и органогенез совершаются в совокупности, причем в определенных участках зародыша и в определенное время. Это свидетельствует о координированности и интегрированности эмбрионального развития.

В настоящее время общепринятой считается точка зрения на дифференцировку клеток в процессе онтогенеза как на результат последовательных реципрокных (взаимных) влияний цитоплазмы и меняющихся продуктов активности ядерных генов. Таким образом, впервые прозвучала идея о дифференциальной экспрессии генов как основном механизме цитодифференцировки. Уровни регуляции дифференциальной экспрессии генов соответствуют этапам реализации информации в направлении ген → полипептид → признак и включают не только внутриклеточные процессы, но и тканевые и организменные.

Эмбриональная индукция – это взаимодействие частей развивающегося зародыша, при котором один участок зародыша влияет на судьбу другого участка. В настоящее время установлено, что первичным эмбриональным индуктором является хордомезодермальный зачаток в спинной губе бластопора. Но явления индукции многочисленны и разнообразны. Кроме первичной индукции, различают вторичные и третичные , которые могут происходить на более поздних, чем гаструляция, этапах развития. Все эти индукции представляют собой каскадные взаимодействия , потому что индукция многих структур зависит от предшествующих индукционных событий. Например, глазной бокал возникает только после развития передней части головного мозга, хрусталик – после формирования бокала, а роговица – после образования хрусталика.

Индукция носит не только каскадный, но и переплетающийся характер, т.е. в индукции той или иной структуры может участвовать не одна, а несколько тканей. Например, глазной бокал служит главным, но не единственным индуктором хрусталика.

Различают два вида индукции. Гетерономная индукция – когда один кусочек зародыша индуцирует иной орган (хордомезодерма индуцирует появление нервной трубки и всего зародыша в целом). Гомономная индукция – индуктор побуждает окружающий материал к развитию в том же направлении, что и он сам. Например, область нефротома, пересаженная другому зародышу, способствует развитию окружающего материала в сторону формирования головной почки, а прибавление в культуру фибробластов сердца маленького кусочка хряща влечет за собой процесс образования хряща.

Для того чтобы воспринять действие индуктора, компетентная ткань должна обладать хотя бы минимальной организацией. Одиночные клетки не воспринимают действие индуктора, а чем больше клеток в реагирующей ткани, тем активнее ее реакция. Для оказания индуцирующего действия иногда достаточно лишь одной клетки индуктора. Установлена химическая природа индукторов – это могут быть белки, нуклеопротеиды, стероиды и даже неорганические вещества. Но специфичность ответа прямо не связана с химическими свойствами индуктора.

Таким образом, генетический контроль онтогенеза очевиден, однако в процессе развития зародыш и его части обладают способностью к саморазвитию, регулируемому самой целостной развивающейся системой и не запрограммированному в генотипе зиготы.

2 . Ведущая роль ядра в регуляции формообразования

Реализация наследственной информации в онтогенезе многоступенчатый процесс. Он включает в себя различные уровни регуляции – клеточный, тканевый, организменный. На каждом этапе развития организма функционирует большое количество генов. Каждый из них контролирует ход той или иной биохимической реакции и через нее принимает участие в осуществлении формообразовательных процессов. Локализация генов в хромосомах ядер определяетведущую роль ядра в регуляции формообразования. Однако по этому поводу длительное время происходили дискуссии, в особенности между эмбриологами и генетиками. Первые отводили основную роль цитоплазме, вторые – ядру. Затем был найден компромиссный вариант, согласно которому ядро отвечает за видоспецифические признаки организмов, а цитоплазма – за более общие признаки.

Правота генетиков была продемонстрирована лишь в 30-е годы ХХ века в опытах физиолога растений Г.Хеммерлинга. Он обнаружил, что у одноклеточной водоросли АсеtаЬulаriа форма шляпки (зонтика) – органа размножения, развивающегося на верхушке стебля, зависит только от ядра. Так, если у водоросли одного вида – АсеtаЬulаriа mediterranea удалить содержащий ядро ризоид и срастить со стебельком ризоид с ядром другого вида – А. wettsteini или А. crenulata, то образуется шляпка, свойственная А. wettsteini или А.crenulata , и наоборот (рис. 15).

В 50-е годы ХХ в. Б.Л.Астауров использовал для доказательства ведущей роли ядра в развитии животных разную чувствительность ядра и цитоплазмы к действию радиации – ядро во много раз чувствительнее к облучению, чем цитоплазма. Исследования проводились на яйцах тутового шелкопряда. Яйца, лишенные женского ядерного аппарата (путем облучения высокой дозой рентгеновских лучей), при оплодотворении необлученной спермой образуют ядро дробления посредством слияния ядер двух спермиев. Соответствующие особи всегда самцы и их легко узнают при помощи генетической маркировки. Если, используя эту методику, соединить цитоплазму яиц одного вида с ядром яиц другого вида тутового шелкопряда, отличающимся по многим морфологическим, физиологическим признакам и поведению, то оказывается, что развивающийся организм целиком и полностью подобен отцовскому, т.е. соответствует информации, содержащейся в ядре.

Аналогичные исследования проводились и с позвоночными животными. Первым этот вопрос исследовал французский эмбриолог К.Гальен-младший. Он использовал метод трансплантации ядер в яйцеклетки амфибий, который, как считают, разработан американскими эмбриологами Бриггсом и Кингом в 50-е годы прошлого столетия и позднее усовершенствован английским ученым Джоном Гердоном. В действительности этот метод был разработан еще в 40-е годы ХХ в. русским ученым, основоположником отечественной экспериментальной эмбриологии Георгием Викторовичем Лопашовым. Суть метода заключается в том, что собственное ядро яйцеклетки удаляется и чужеродное ядро–донор впрыскивается в яйцеклетку.

Именно путем межвидовых пересадок ядер Гальен получил ядерно-цитоплазматические гибриды с разной конституцией. Начиная со стадии ранней гаструлы, у них обнаруживались тяжелые нарушения развития. Однако небольшое число таких гибридов (около 2%) достигает взрослого состояния. Все особи по своим признакам подобны представителям того вида, от которого взято трансплантированное ядро.

Таким образом, можно утверждать, чтоспецифические особенности индивидуального развития контролируются клеточным ядром .

Ядро, несущее наследственный материал, в котором записана программа индивидуального развития, характеризуется следующими особенностями:

– играет ведущую роль в регуляции формообразовательных процессов.

– осуществляет эту роль посредством ядерно-цитоплазматических взаимоотношений, т.е. разная цитоплазма индуцирует разные функциональные состояния находящегося в клетке ядра.

– в ходе регуляции индивидуального развития проявляет периодичность морфогенетической активности.

Рис. 15. Эксперименты Хеммерлинга, доказывающие выработку ядром ацетобулярии вещества, необходимого для регенерации шляпки (Л.И.Корочкин,1999)

3 . Особенности взаимодействия генов в

развитии организма

Многочисленные исследования в области генетики развития, эмбриологии и генетики свидетельствуют о том, что механизмы онтогенеза на различных уровнях являютсяуниверсальными и консервативными .

Можно сказать, что строительные «кирпичики», а порою и целые блоки, из которых складывается будущий организм, похожи друг на друга. Сходны и системы управления «строительством». А специфика развития разных организмов формируется за счет временных и пространственных различий в последовательности соединения этих «кирпичиков» в некое целостное «образование».

В результате были сформулированы общие закономерности генетической регуляции онтогенеза, которые проявляются в ходе такого «строительства». Эти закономерности касаются, во-первых,взаимодействия генов в развитии , во-вторых,организации генных систем , контролирующих развитие, в-третьих,особенностей функционирования этих систем.

Особенности взаимодействия генов в развитии организма следующие.

1. Основу индивидуального развития составляет взаимодействие генов , ихсистемное , а не автономное функционирование.

2. Система генов, регулирующих развитие того или иного признака (или морфогенетического процесса) организована поиерархическому принципу , так что в каждом регуляторном генетическом «каскаде» существуют « гены–господа » и « гены–рабы ». Первые – гены-господа – в случае их активации «разрешают» реализацию определенного морфогенетического процесса и включают «каскад» генов, которые этот процесс осуществляют – гены-рабы (рис. 16).

3. Генетические и молекулярно-генетические системы, управляющие развитием, удивительно консервативны и присущи как примитивным, так и высоко развитым организмам. Например, определенный мышиный ген способен заменить другой ген дрозофилы и «запустить» процесс развития глаза в ходе метаморфоза развивающейся мухи. Специфичность развивающегося органа (возникает-то глаз дрозофилы, а не мыши), очевидно, обусловлена особенностями функционирования регуляторных и структурных генов конкретного «каскада», которые химически обеспечивают морфогенез данного органа. От них может зависеть синтез продуктов, которые обеспечивают специфические межклеточные взаимодействия, определяющие становление вполне конкретной формы .

4. Весь процесс индивидуального развития осуществляется на основе двух типов воздействия генов друг на друга:активирующие воздействия итормозящие воздействия. Таким образом, развитие эмбриона, спецификация его клеток, их взаимовлияния в ходе морфогенеза основаны на «игре» этих факторов и установлении некоего «баланса» между ними. Итогом этого баланса является неравномерное распределение генопродуктов вдоль эмбриональных осей, так что создается своеобразная молекулярная мозаика, химически преформированный «план строения» организма, воплощаемый в жизнь в ходе онтогенеза.

Рис. 16. Схема генетического контроля индивидуального развития

на разных его этапах (Л.И.Корочкин, 1999)

Специфическое соотношение разных генопродуктов в различных регионах зародыша по сути дела и есть молекулярно-генетическая основа так называемойпозиционной информации , т.е. зависимости судьбы той или иной клетки от того положения (позиции) в системе развивающегося организма, которое она занимает. А «сигналом», передающим позиционную информацию, как раз и являются особенности молекулярной «микросреды», в пределах которой происходит становление данной клетки (или клеток).

4. Особенности функционирования генетических

систем, контролирующих развитие

Можно выделить следующие особенности функционирования генетических систем, контролирующих развитие организмов.

1. «Опережающее» функционирование генов в ходе онтогенеза. Известно, что многие продукты синтезируются в развивающемся зародыше «заранее», часто задолго до того, как они будут востребованы. Это, в частности, вещества, которые участвуют в «разметке» плана строения организма (продукты генов сегментации, гомеозисных генов), в осуществлении эмбриональной индукции (индуцирующие вещества и их ингибиторы). Некоторые молекулы, например, глобин, образуются еще в яйцеклетке, задолго до того, как они начнут выполнять свои функции в клетках эритроидного ряда.

2. Автономия частей при единстве целого. Это качество функциональной динамики генома отчетливо проявляется в раннем эмбриогенезе при созревании индуктора (хордомезодермы) и компетентной ткани (нейроэктодермы). Очевидно, что генетические системы, которые регулируют созревание индуцирующих свойств хордомезодермы и способность компетентной ткани реагировать на воздействие индуктора, функционируют вавтономном режиме независимо от того, находится ли данная развивающаяся эмбриональная закладка в составе целого зародыша или вне его.Целостность же развивающейся системы обеспечивается за счет того, что в норме сроки созревания двух взаимодействующих тканей строго «подогнаны» один к другому, как бы «синхронизированы», в результате чего достигается нормальное течение онтогенетического процесса.

Мутации, которые вызывают рассогласование времени созревания взаимодействующих систем в развитии, нарушают целостность и гармонию морфогенетических событий и ведут к появлению различного рода дефектов развития.

3. Можно выделитьтри автономно функционирующие генетические системы , которые соответственно контролируют три автономных процесса – формообразовательные события , дифференцировка специфических морфологических типов клеток и химическая спецификация этих клеток .

Например, известны случаи, когда процесс нейруляции проходит нормально и нервная трубка замыкается, однако дифференцировки входящих в ее состав нейробластов не происходит. Напротив, в случаях нарушения замыкания нервной пластинки в нервную трубку наблюдалась дифференцировка нейробластов этой пластинки в нервные клетки, морфологически вполне развитые.

ЛЕКЦИЯ 11

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССА ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ОРГАНИЗМОВ

Гормоны, регулирующие некоторые процессы индивидуального развития.

Процесс роста и его регуляция.

1. Гормоны, регулирующие некоторые процессы индивидуального развития

Гормоны, влияющие на индивидуальное развитие, можно подразделить на две группы в зависимости от их источника.

1. Гормоны, синтезируемые в материнском организме , среди которых существенна группа гормонов, регулирующих репродуктивную функцию (процессы гаметогенеза, овуляции, и раннего эмбриогенеза). У млекопитающих ввиду внутриутробного характера развития эти гормоны, проникая через плаценту, могут оказывать воздействие не только на процессы гаметогенеза, но и на зародышевое развитие.

2. Гормоны, вырабатываемые эндокринной системой развивающегося организма и регулирующие рост, дифференцировку и специфическую физиолого-биохимическую деятельность клеток на конечных этапах их дифференцировки.

Гормональный контроль гаметогенеза . Процессы созревания половых клеток носят циклический или сезонный характер. Параметры циклов и сезонная активность гаметогенеза регулируются гормонами, продуцирующимися яичником и семенником. В свою очередь гормональная активность гонад находится под контролем гонадотропинов – гормонов гипофиза. Благодаря системной регуляции гормонами, гаметогенез и процессы созревания ооцитов скоординированы с деятельностью всех гистофизиологических элементов половой системы, включая подготовку и синхронизацию процессов, которые обеспечивают оплодотворение созревших половых продуктов, а у млекопитающих – подготовку условий, необходимых для эмбриогенеза. В оогенезе гормоны в наибольшей степени контролируют период большого роста ооцитов, их созревание и овуляцию.

Гормональный контроль некоторых органогенезов и гисто генезов . В период закладки зародышевых листков и зачатков основных органов собственные гормоны эмбрион еще не продуцирует, и регуляция процессов развития осуществляется в результате индукционных взаимодействий контактирующих клеток и клеточных слоев. Во время органогенезов и гистогенезов появляются гормоны, роль которых постепенно возрастает. Роль гормонов в органогенезах и гистогенезах хорошо изучена не во всех случаях, но исследователи полагают, что все органы и тканевые системы на том или ином этапе своего развития испытывают их регулирующее действие, необходимое для координированного роста, цитофизиологической дифференцировки и функционирования.

Роль гормонов хорошо исследована в развитии репродуктивных органов млекопитающих, в синтезе компонентов яйца в яйцеводе птиц, при развитии молочной железы. Хорошо изучена гормональная регуляция метаморфоза у амфибий и насекомых.

Роль гормонов в развитии репродуктивных органов . Развитие мужских и женских репродуктивных органов, гонад, системы выводящих протоков и наружных половых органов представляет собой хороший пример гормонального контроля органо- и гистогенезов. Рассмотрим, как осуществляется этот контроль у млекопитающих.

У млекопитающих гормоны определяют развитие только системы протоков репродуктивных органов самца; при отсутствии гормонов во всех случаях (в том числе и у генетически детерминированных самцов) развивается женская система протоков, т.е. из мюллерова протока формируется яйцевод, а мезонефрос и вольфов проток дегенерируют. В развитии мужских выводящих протоков играют роль два гормональных фактора, вырабатываемых клетками эмбрионального семенника: тестостерон , продуцируемый интерстициальными клетками (клетки Лейдига), и фактор, продуцируемый клетками Сертоли. Тестостерон – ответствен за развитие семявыносящего протока из вольфова канальца и наружных половых органов, а фактор, вырабатываемый клетками Сертоли, – за дегенерацию мюллерова протока (при его отсутствии мюллеров проток у самца сохраняется).

В развитии женских половых протоков гормоны не участвуют. Предполагается, что такой принцип (зависимое от гормонов развитие мужских и независимое от гормонов развитие женских протоков) служит приспособлением, связанным с внутриутробным характером развития млекопитающих, у которых женские гормоны легко проникают через плаценту и даже вырабатываются в самой плаценте. Если бы гормоны–эстрогены влияли на половую дифференциацию, они бы препятствовали развитию репродуктивных органов самцов в утробе матери.

Таким образом, развитие характерных для самца репродуктивных органов связано с совокупным последовательным действием двух факторов:

1) генетического , т.е. продукта активности гена У-хромосомы (Н – У-антиген), который стимулирует клетки мозговой части недифференцированной половой железы к образованию канальцев семенника;

2) гормонального – тестостерона и фактора, вырабатываемого клетками Сертоли, которые побуждают вольфов проток и верхний отдел мезонефроса к формированию системы семявыносящих протоков; одновременно эти гормоны вызывают дегенерацию мюллерова протока. В дальнейшем под влиянием тестостерона развивается и система наружных половых органов самца.

Развитие молочной железы . Развитие молочной железы и индукция в ее альвеолах синтеза и секреции молока также представляет собой яркий пример сложной гормональной регуляции процесса развития органа и его гисто-физиологического и функционального созревания.

У новорожденных животных (или человека) млечные железы представлены еще недоразвитой системой протоков – эктодермальными углублениями в подлежащую мезенхиму. С наступлением половой зрелости в крови повышается уровень эстрогена , который индуцирует дальнейшее разветвление и увеличение массы протоков железы. Но окончательная гисто-цитологическая дифференцировка и формирование секретирующих альвеол в конечных отделах протоков происходят в период беременности под влиянием большой группы гормонов – прогестерона , пролактина и лактогена , а в дальнейшем – в период кормления – высокий уровень пролактина поддерживает процесс лактации.

Гормональная регуляция системы синтеза компонентов яйца в яйцеводе птиц . Железистые клетки яйцевода птиц – хорошо изученная модель гормонального контроля за гисто-физиологической дифференцировкой синтеза специфических белков. Детальная морфологическая дифференцировка клеток, вырабатывающих, например, овальбумин (яичный белок), начинается лишь в период половозрелости под влиянием гормонов.

В яйцеводе птиц последовательно расположены отделы, в которых клетки специализированы на секрецию разных составных частей сложной оболочки яйца, – белка, подскорлуповых оболочек, скорлупы. В яйцеводе неполовозрелых животных эти отделы не функционируют. Однако если животным ввести эстроген, клетки эпителия яйцевода начинают пролиферировать и дифференцироваться, образуя трубчатые железы. В свою очередь клетки желез синтезируют и секретируют компоненты яичного белка.

Эстроген вызывает также дифференцировку специализированных клеток следующего отдела (гоблетовские клетки), синтезирующих овидин, но для индукции его синтеза необходимо присутствие прогестерона. В настоящее время хорошо изучены молекулярно-биологические аспекты индукции и синтеза овальбумина, детально исследована структура и экспрессия гена этого белка.

Большинство генов эукариот, в отличии от генов прокариот имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки (экзоны) чередуются с некодирующими участками (интроны). Регуляторные элементы гена - промоторы, определяющие точность инициации, транскрипции, локализованы перед первым экзоном на 5"-конце нити ДНК и представлены несколькими элементами (ТАТА-, ССААТ-боксы, GC-мотив).

Экспрессия генов регулируется также усилителями (энхансеры), ослабителями (сайленсоры), а также инсуляторами (ограничители действия энхансеров) и элементами отклика, взаимодействующими с факторами транскрипции, ксенобиотиками, стероидными гормонами и др. Эти последовательности участвуют в определении частоты инициации транскрипции .

Первый этап реализации генетической информации - транскрипция. Гены эукариот транскрибируются в виде предшественника, который состоит из экзонов и интронов (незрелая иРНК). Затем интроны вырезаются специальными ферментами, а экзоны последовательно сшиваются друг с другом, формируя готовый для трансляции транскрипт (зрелая иРНК). Этот процесс получил название сплайсинга. Одна и та же последовательность ДНК может кодировать несколько различных белков, благодаря так называемому альтернативному сплайсингу (образование разных иРНК за счет изменения чередования соединения экзонов из одного первичного РНК-транскрипта).

После транскрипции или параллельно с ней незрелая иРНК подвергается дальнейшей модификации. К 5"-концу пре-иРНК с помощью фермента присоединяется метилированный остаток гуанина в 7-м положении пуринового кольца (процесс копирования). Считается, что кэп (шапочка) необходима для правильной ориентации и присоединения рибосом к иРНК перед началом трансляции. К З"-концу пре-иРНК также ферментативно присоединяется короткая нуклеотидная последовательность, состоящая из остатков аденина (полиаденилирование). Полагают, что поли-А-последовательность необходима для транспорта иРНК через ядерную мембрану в цитоплазму .

По выполняемой функции в клетке эукариотические гены делятся на несколько групп.

Первую группу составляют гены, экспрессирующиеся во всех типах клеток. Продукты их деятельности - белки, необходимые для обеспечения жизнедеятельности любой клетки организма (гены рибосомальных РНК, гистонов и др.).

Вторая группа - тканеспецифические гены, которые функционируют только в определенных типах клеток или тканях на определенных стадиях онтогенеза (гены глобулинов, альбумина, а-фетопротеина, иммуноглобулинов, мышечных белков, секреторных белков эндокринных и пищеварительных желез и многие другие).

Третью группу составляют гены, которые кодируют различные белки, участвующие в регуляции транскрипции (транскрипционные факторы). Белковые продукты этих генов взаимодействуют с регуляторными участками генов, вызывая усиление или подавление экспрессии.

К четвертой группе относят гены, экспрессия которых индуцируется внешними факторами, в том числе ксенобиотиками.

Одной из основных задач фармакогеномики является изучение экспрессии генов при различных заболеваниях и воздействии того или иного лекарства или биологически активного соединения. Это позволит определять возможность их направленной регуляции.

Успешное внедрение фармакогеномики в экспериментальную фармакологию стало возможным благодаря развитию соответствующих технологий в том числе и информационных (биоинформатика). Все они ассимилировали и интегрировали фармакогенетику в широкое научное направление.

В целом, все методы ДГЭ состоят из множества, часто повторяющихся одних и тех же операций. Выполнение их вручную малоинтересное занятие. Однако угрозой не является монотонная работа оператора, а значительно большей проблемой считается бесконечное повторение одних и тех же операций, что может привести к потере точности. Поэтому перед фармакогеномическими технологиями стоит одна задача - частичная или полная автоматизация аналитических операций.

Основой любой технологии является метод, имеющий в аналитической практике свои характеристики (параметры). Для ДГЭ они должны соответствовать следующим требованиям:

Разрешающая способность, связана с определенной точностью определения соседних генов;

Чувствительность - граница «-последовательностей разведения, дающих возможность статистически достоверно регистрировать изменения ДГЭ;

Охват - процент экспрессированных генов данного вида экспериментальных животных или определенной ткани, которые могут быть надежно определены и экспериментально повторяться;

Фальшпозитивная норма - количество генов, ошибочно отнесенных к экспрессированным;

Фальшнегативная норма - количество экспрессированных генов, однако отнесенных к неактивным.

Технологии ДГЭ включают две группы методов. Одна из них, так называемая закрытая, а вторая - открытая архитектурная система .

Закрытая архитектурная система требует информацию о каждом гене или клоне и использует в качестве анализатора микрочипы.

Теория создания микрочипов основана на гибридизации олигонуклеотидов известной последовательности, иммобилизованных на твердой поверхности в строго определенных местах, с меченой различными способами пробой. Способствовали созданию данной технологии последние достижения в информатике, химии полупроводников, микроэлектронной промышленности, а также обилие информации, которая накопилась за годы работы над программой «Геном человека».

ДНК-чип - миниатюрная пластина с микроячейками. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированные олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам определенных генов, выступающих в качестве матрицы. В этих ячейках происходит комплементарное взаимодействие матрицы и пробы (кДНК исследуемых образцов). В настоящее время существует два направления в создании ДНК-чипов. Они различаются способом синтеза и нанесения матричных олигонуклеотидов .

Первое направление основано на предварительном синтезе олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезируют химически или с помощью ПЦР (длина от 500 до 5000 оснований) и затем наносят на обработанную специальным образом стеклянную поверхность с помощью роботов. Такие типы чипов получили название кДНК-микрочипов (cDNA-microarray). В ПЦР ампли- фицируются последовательности кДНК определенных генов. Поэтому данный тип чипов дорогостоящий, так как необходимо создавать собственную кДНК-библиотеку или приобретать ее у крупных исследовательских центров.

кДНК-Микрочипы оказались непригодными для проведения исследований полиморфизма (генетическая изменчивость отдельного локуса в определенной популяции), мутационного анализа, сравнительного изучения экспрессии большого количества генов, так как плотность размещения матричных олигонуклеотидов очень ограничена (число ячеек составляет = 1000 на чип). Кроме того, применение длинных фрагментов ДНК (кДНК) снижает специфичность гибридизации с исследуемой пробой и появляются ложноположительные сигналы, не соответствующие реальной экспрессии генов.

Несмотря на перечисленные недостатки, основное преимущество кДНК-микрочипов - возможность варьирования качественным и количественным составом фрагментов генов.

Более перспективное направление создания чипов - применение фотолитографических технологий , которые дают возможность одновременно интегрировать огромное количество олигонуклеотидов любой последовательности непосредственно на поверхности чипа. Плотность размещения синтезированных таким образом нуклеотидов может достигать 1 млн. на 1 см2. Такие чипы, получившие названия ДНК-чипов (DNA-chips), производятся фирмой Affymetrix Inc. Матрица ДНК-чипа - короткая (20-25-мерная) олигонуклеотидная последовательность, причем каждому гену соответствует 15-20 таких олигонуклеотидов, что значительно повышает точность и воспроизводимость результатов. ДНК-чипы позволяют одновременно оценивать экспрессию практически неограниченного количества генов, производить исследование полиморфизма, в том числе и однонуклеотидных замен (SNP). В этом случае синтезируются олигонуклеотиды, специфические для каждой последовательности конкретного гена, учитывая все возможные варианты взаимного расположения нуклеотидов.

При проведении исследований чип гибридизуется с меченой различными способами пробой. При сравнительных исследованиях пробой, как правило, служит кДНК, полученная из контрольного и сравниваемого образцов. В качестве метки используются как радиоактивно меченые молекулы, так и флуоресцентные красители, непосредственно присоединенные к исследуемым образцам. При проведении сравнительного анализа обычно применяют двухцветную детекцию, при которой контрольная и опытная кДНК метятся разными красителями. Результаты регистрируют по интенсивности гибридизационных сигналов тех ячеек чипа, где произошла гибридизация, с последующей компьютерной обработкой данных.

Производятся и упрощенные варианты чипов с небольшим набором генов (в пределах 1000-2000). На нейлоновой мембране фиксируются короткие последовательности известных генов. Они гибридизуются с радиоактивно меченой пробой. Гибридизация детектируется методом радиоавтографии.

Следует отметить, что работа с чипами требует специального дорогостоящего оборудования для проведения гибридизации. Ожидается, что в ближайшие годы цены на комплекты оборудования для производства чипов и работы с ними будут снижены в связи с насыщением рынка.

Разработка и внедрение в науку и практику новых технологий часто является движущим моментом в развитии медикобиологических отраслей знаний как, например, это было с разработкой в недавнем прошлом технологии ПЦР. Развитие молекулярной биологии в настоящее время многим обязано ПЦР, а теперь и микрочипам. Внедрение технологии микрочипов принципиально и для фармакологии. Разработка новых лекарственных средств уже сейчас начинает основываться на информации о функциональной роли определенных генов в развитии патологии. Поэтому сроки разработок могут сократиться с 10-15 до 5-8 лет }

КАТЕГОРИИ